Proprietati chimice

Hidroliza proteinelor si peptidelor naturale. Analiza compozitiei în aminoacizi a unei proteine native sau a unei peptide naturale este deosebit de importanta pentru studiul structurii chimice a acestora. Totodata, ea pune multe probleme printre care, cea mai importanta o constituie puritatea materialului folosit pentru analiza. Acest material nu trebuie sa fie impurificat cu substante cu masa moleculara mica (saruri utilizate la purificare, lipide, glucide, ioni metalici etc.). Gruparile prostetice ale heteroproteinelor se separa de componentele proteice înainte de a se trece la hidroliza acestora din urma. În functie de modul de realizare, hidroliza peptidelor si proteinelor este de mai multe tipuri.

1. Hidroliza acida. Proteina supusa analizei este liofilizata si redizolvata în solutie de HCl 5,7 N la care se adauga câteva picaturi de fenol 5%. În fiola în care a fost realizat amestecul de hidroliza se introduce azot sau se creeaza vid pentru a preîntâmpina oxidarea, dupa care se încalzeste pe baia de apa la 40°C timp de 30 de secunde sub agitare usoara, pentru îndepartarea completa a oxigenului. Se realizeaza apoi hidroliza la 105 - 110°C în fiola din sticla termorezistenta timp de 24 - 72 de ore dupa care fiola se raceste, iar acidul este îndepartat la rotavapor. Reziduul obtinut se redizolva într-un volum minim de apa bidistilata si se evapora din nou la sec.

Pentru determinarea calitativa si cantitativa a aminoacizilor în hidrolizatul obtinut se folosesc analizoare automate de aminoacizi, cu înregistrare automata care furnizeaza direct datele necesare calcularii continutului procentual al fiecarui aminoacid prezent în proteina analizata. De regula, pentru obtinerea unor rezultate cât mai exacte, se folosesc 0,4 - 0,5 mg de proteina nativa.

Hidroliza acida a proteinelor se poate realiza si cu alti acizi. Rezultate bune se obtin de exemplu si cu acid performic. Acesta se obtine amestecând 9 volume acid formic 80% cu un volum de H₂O₂ 30%. Amestecul se agita si se lasa în repaus 30 minute la +4°C.

Indiferent de agentul folosit si de precautia de a înlatura oxigenul, hidroliza acida a proteinelor si peptidelor este întotdeauna însotita de oxidarea unor aminoacizi. Astfel, cisteina si cistina trec usor în acid cistic, metionina trece în metionin-sulfona, tirozina si triptofanul sunt complet distruse, iar treonina si serina se oxideaza în proportie de 5 - 10%. Pentru evitarea acestor fenomene secundare, se recomanda realizarea unei hidrolize acide partiale, adica hidroliza la intervale de timp diferite de 24, 48 si 72 de ore.

2. Hidroliza cu bromcian sau iodacetamida. Aceasta metoda se bazeaza pe faptul ca în mediu acid, bromcianul (BrCN) sau iodacetamida (ICH₂ - CO - NH₂) scindeaza specific legaturile peptidice formate de metionina rezultând lactona homoserinei:

Scindarile cu ajutorul bromcianului si iodacetamidei dau posibilitatea obtinerii unor fragmente polipeptidice mai scurte ce pot fi ulterior analizate prin alte metode.

3. Hidroliza secventiala începând cu extremitatea N-terminala. Aceasta poarta numele de metoda Edman de degradare a proteinelor si foloseste ca reactiv fenil-tioizocianatul. Proteina de analizat se dizolva într-o solutie tampon adecvata dupa care se trateaza cu fenil-tioizocianat în prezenta de acid trifluoracetic si în absenta totala a oxigenului. Derivatii aminoacizilor N-terminali rezultati se identifica apoi prin cromatografie în strat subtire.

4. Hidroliza secventiala începând cu extremitatea C-terminala. Aceasta metoda utilizeaza carboxipeptidazele, enzime capabile sa hidrolizeze succesiv câte un aminoacid de la capatul C-terminal. Dupa fiecare etapa, aminoacizii sunt separati prin dializa si determinati calitativ si cantitativ.

5. Hidrazinoliza este o alta metoda de determinare a aminoacidului C-terminal. În prezenta hidrazinei, toate legaturile peptidice sunt rupte si toti aminoacizii, cu exceptia aminoacidului C-terminal, trec în hidrazide. Aminoacidul C-terminal se poate apoi identifica, fie cu ajutorul reactivului 2,4-dinitrofluorbenzenic, fie cu ajutorul clorurii de dansil. 

Cei doi derivati ai dinitrobenzenului (a si b) au solubilitati diferite si pot fi separati din amestec prin diferite procedee de extractie bazate pe diferenta de solubilitate.

6. Hidroliza enzimatica nespecifica. Acest tip de scindare hidrolitica se realizeaza în conditii blânde de reactie. În principiu, orice proteina sau polipeptida poate fi scindata complet în prezenta enzimelor proteolitice din clasa hidrolazelor. Din punct de vedere practic însa, acest procedeu este foarte laborios.

În primul rând, hidroliza enzimatica completa nu se poate realiza cu o singura enzima ci cu un set de mai multe enzime alese în functie de natura proteinei analizate.

7. Hidroliza enzimatica la pH acid. Acest procedeu este utilizat în cazul proteinelor ce se denatureaza la pH acid. Proteina de analizat este mai întâi supusa denaturarii cu o solutie de guanidina sau de uree, urmata de dializa la pH acid. La proteina astfel denaturata se adauga apoi pepsina, subtilizina, aminopeptidaza si prolidaza. Uneori, în functie de natura proteinei analizate, se înlocuieste subtilizina, care este o proteinaza de origine microbiana, cu papaina extrasa din arborele Carica papaya.

Hidrolizatul obtinut este liofilizat, redizolvat în acid acetic 5% si liofilizat din nou. Gradul de hidroliza enzimatica la pH acid este controlat permanent analizând hidrolizatul prin cromatografie sau electroforeza.

8. Hidroliza enzimatica la temperaturi moderate se realizeaza în prezenta papainei, leucinaminopeptidazei si prolidazei. Proteina este denaturata prin încalzire timp de 3 minute la 95°C, iar dupa racire se tamponeaza la pH = 5,2. Hidroliza se realizeaza apoi timp de 18 - 24 de ore la 40°C, iar hidrolizatul obtinut se analizeaza prin metode specifice.

9. Hidroliza enzimatica specifica. Aceasta metoda consta în utilizarea unor preparate pure de tripsina si chimotripsina, enzime ce hidrolizeaza specific legaturile peptidice formate de anumiti aminoacizi. Tripsina de exemplu, hidrolizeaza legaturile peptidice formate de resturile de lizina si arginina, iar chimotripsina pe cele realizate de leucina, fenilalanina si tirozina.